全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 45-50.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.008

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全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

张荣耀¹，毕晓娟²，马艳²，段显琳^1，2，江明^1，2

1新疆医科大学第一附属医院血液病中心，新疆血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
2新疆医科大学临床医学研究院干细胞室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-11-25 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 江明，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院血液病中心，新疆血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆医科大学临床医学研究院干细胞室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054
作者简介:张荣耀，男，1985年生，湖北省十堰市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事造血干细胞移植、血液病的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821113)

Biological characterization of C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells using a whole bone marrow adherent culture technique

Zhang Rong-yao¹, Bi Xiao-juan², Ma Yan², Duan Xian-lin^{1, 2}, Jiang Ming^{1, 2}

1Hematology Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
2Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-11-25 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Jiang Ming, Master, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Hematology Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Rong-yao, Studying for master’s degree, Hematology Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 200821113

摘要/Abstract

摘要：

背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理，虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖，但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态，能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子，保持间充质细胞生长的微环境，提高间充质干细胞的产量。
目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。
结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力，流式细胞仪检测表达CD45，CD105和Sca-1，不表达CD34，CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征；细胞倍增时间(57.11±1.5) h；诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力；细胞周期分析表明64%的细胞处于G0-G1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 培养, 骨髓间充质干细胞, 细胞培养, 分化, 成软骨诱导, 成骨诱导, 成脂诱导, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Under mitomycin C treatment, feeder cells appear to have restricted proliferation, but they are still able to secret different cytokines. Non-mesenchymal stem cells from the bone marrow and secreted factors in plasma maintain the micro-environment suitable for the growth of mesenchymal stem cells that can improve the yield of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To study the biological characteristics of C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells isolated using a whole bone marrow adherent culture technique.
METHODS: Using the whole bone marrow adherent culture technique, purified and amplified C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells were harvested. Cell proliferation kinetics, immune cell surface markers, multiple differentiation potential and cell cycle were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Using the whole bone marrow culture, mouse bone marrow mesenchymal stem cells were harvested and capable of adhering to the plastic culture vessel. The obtained cells expressed CD45, CD105 and Sca-1, but were negative for CD34, CD33 and C-kit. The doubling time was (57.11±1.5) hours. The cells could be induced to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. The cell cycle analysis showed that 64% of cells were in G0-G1 phase. These indicates that C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells isolated using a whole bone marrow adherent culture technique have biological characteristics of mesenchymal stem cells.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, cell culture techniques, induced pluripotent stem cells

中图分类号:

R394.2

张荣耀，毕晓娟，马艳，段显琳，江明. 全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 45-50.

Zhang Rong-yao, Bi Xiao-juan, Ma Yan, Duan Xian-lin, Jiang Ming . Biological characterization of C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells using a whole bone marrow adherent culture technique[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 45-50.

图/表（结果） 3

2.1 分离培养的骨髓间充质干细胞的形态 全骨髓液在接种的原代细胞培养两三天后，可见散在的，呈三角形、梭形或多角形，48 h后首次全量换液后可见贴壁的圆形细胞生长为星形、不规则形，并可见的贴壁细胞和少量的细胞集落形成，4 d后生长速度加快，可见细胞克隆明显增多形成，细胞形态不一。当培养10 d左右细胞汇合率可达80%，倒置显微镜下可见贴壁细胞呈梭形、三角形和多角形。传代后贴壁细胞呈旋涡状生长，贴壁后可见少许悬浮细胞，换液后悬浮细胞消失。传至第3代的细胞形态多为长梭形，与原代培养细胞的形态有较明显差异(图1)。

2.2 骨髓间充质干细胞的生长曲线 培养第3代的骨髓间充质干细胞约72 h时进入明显的对数增长期，但细胞增殖速度较慢，在对数生长期，细胞倍增时间为(57.11±1.5) h，约在第6天后进入平台期，提示体外骨髓间充质干细胞增殖相对稳定(图2A)。

2.3 骨髓间充质干细胞的细胞周期分析结果 流式细胞仪检测发现第3代骨髓间充质干细胞中64%细胞处于G₀-G₁期，其余36%细胞处于S+G₂期(图2B)。

2.4 骨髓间充质干细胞的免疫表型分析结果 流式细胞仪检测结果显示，小鼠骨髓间充质细胞中74.6%呈CD45阳性，24.3%呈CD105阳性，32.1%呈Sca-1阳性，仅0.1%呈C-kit阳性，0.2%呈CD133阳性，0.8%呈CD34阳性，由此初步说明从骨髓中分离出来的贴壁细胞为间充质干细胞(图3A1-A6)。

2.5 培养的骨髓间充质干细胞的分化潜能当成骨诱导第19天，培养的骨髓间充质干细胞出现钙结节形成，经茜素红染色呈现红色(图3B)；脂肪诱导第5天，培养的骨髓间充质干细胞胞浆内形成脂滴，第7天时经油红O染色呈现红色强阳性(图3C)；培养的骨髓间充质干细胞经软骨诱导分化21 d，经甲苯胺蓝染色呈阳性(图3D)。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2012年10月至2013年5月在新疆医科大学临床医学研究院干细胞室完成。

材料：SPF级环境下饲养的健康雄性C57小鼠5只，鼠龄6-8周，体质量约20 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(新)2011-0004，实验过程中对动物的处置遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。

方法：

全骨髓培养法分离、培养及传代骨髓间充质干细胞：按Kopen等^[14]描述的方法获取小鼠骨髓间充质干细胞。简言之，小鼠脱臼处死，在无菌条件获取C57小鼠股骨、胫骨，剔除附着的肌肉，用小鼠间充质干细胞专用培养液[含有10%小鼠间充质干细胞专用添加物(小鼠间充质干细胞刺激补充剂)的小鼠间充质干细胞基础培养液]充分冲洗骨髓腔，将细胞用7号针头吹打成单个核细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹接种于10 mL的培养皿中，置入37 ℃，饱和湿度的体积分数5%CO₂培养箱中，48 h首次换液，首次换液时用缓冲液PBS洗净非贴壁细胞，以后每3 d换液1次，每次换液时用缓冲液PBS洗净非贴壁细胞。待细胞汇合率达80%-90%用PBS洗涤2次，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液，以402×g，离心5 min，弃上清液，计数，调节细胞密度为5×10⁴/cm²接种，传至第3代备用。

细胞增殖能力检测：取培养的第3代细胞，胰蛋白酶消化后，以7×10³/cm²的密度接种于24孔板中，每孔1 mL，置入37 ℃，饱和湿度的体积分数5%CO₂培养箱中，分别于培养第1，2，3，4，5，6，7，8天，各取3孔进行分析，胰酶消化用细胞计数仪计数，取平均值，绘制细胞生长曲线，并计算细胞群体倍增时间。

流式细胞仪检测细胞周期：取培养的第3代细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，用冷PBS清洗2遍，再加入体积分数70%的冷乙醇固定过夜。次日加入10 mg/L的RNA酶， 37 ℃孵育30 min，再加入50 mg/L的二碘化丙锭，避光，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

流式细胞仪检测细胞膜免疫表型：收获培养第3代的骨髓间充质干细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后，加入含血清的小鼠间充质干细胞基础培养基终止消化，402×g，离心5 min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗涤2遍，加入PBS，细胞计数，调节细胞数为1×10⁶L^-¹，分别加入抗小鼠CD34-FITC，CD45-PE，CD105-PE，CD133-Percp，C-kit-PE，Sca-1-FITC，Lin-Cy5.5，4 ℃避光孵育30 min后，用PBS洗涤多余的抗体，在流式细胞仪分析。

细胞的诱导分化：

成骨诱导：取培养第3代的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以5×10⁴/cm²密度接种于35 mm培养皿中，待细胞汇合达80%，吸弃培养液，加入成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠的低糖DMEM)^[15-16]，以加含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM为对照组，每3 d换液1次。诱导约19 d后，在倒置相差显微镜下可见单层细胞上出现黑色的凝聚块后，吸弃上清液，加入40 g/L的多聚甲醛固定30 min，再加入体积分数1%茜素红染液，室温下染色3-5 min后，用自来水冲洗，并在倒置相差显微镜下观察。

成脂诱导：取培养第3代的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以8×10³/cm²密度接种于35 mm培养皿中，待细胞汇合达80%，吸弃培养液，加入成脂诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，10 μmol/L胰岛素的低糖DMEM)^[17]，以加含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM为对照组，隔日换液，诱导约7 d在倒置相差显微镜下可见单层细胞上有部分细胞胞浆中出现大小不均的脂质滴后，吸弃上清液，加入40 g/L的多聚甲醛固定30 min，再加入油红O染液^[18]，室温下染色4.0-5.0 min后，用自来水冲洗，在倒置相差显微镜下观察。

成软骨诱导：取培养第3代的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以8×10³/cm²密度接种于35 mm培养皿中，待细胞汇合达80%，吸弃培养液，加入成软骨诱导液(高糖DMEM培养基，地塞米松10^-⁷ mol/L，胰岛素10 μmol/L，转录生长因子β 500 μg/L，抗坏血酸50 μmol/L)^[19]，以加含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基为对照组，隔日换液。诱导21 d后，石蜡包埋、切片，进行甲苯胺蓝染色鉴定。

主要观察指标：观测细胞生长形态；细胞生长曲线走势和细胞倍增时间；细胞G₀+G₁和G₂+S的百分比；细胞表面免疫表型(CD45，CD105，Sca-1，C-kit，CD133，CD34)；细胞诱导后茜素红、油红O和甲苯胺蓝染色的鉴定结果。

统计学分析：所有数据用SPSS 17.0统计软件(美国SPSS公司)进行数据分析，实验数据以x(_)±s表示。

全文链接：

讨论

1966年Friedenstein等^[1]首次从大鼠骨髓中分离出类似成纤维样形态的细胞，后定义为间充质干细胞，经研究其来源于中胚层具有免疫原性低、自我更新和多向分化的潜能，现已成为细胞治疗和组织工程研究的重点^[10-11^，^14]。后续的研究发现在许人和多动物(如大鼠、猫、狗、狒狒、猕猴、兔、猪、山羊、绵羊和小鼠的相同组织中均可分离获取到间充质干细胞^[20-29]。而C57小鼠的基因与人的基因有99%的相似度，所以C57小鼠有得天独厚的优势，尤其在小鼠骨髓间充质干细胞中作为饲养细胞对造血功能作用机制研究的间充质干细胞细胞更有不可比拟的优势。虽然目前有关于C57小鼠骨髓间充质干细胞生物学特

性研究的报道^[30]，但是由于C57小鼠骨髓腔细短，成熟的造血细胞位于骨髓腔中心间充质细胞多贴近骨内膜和骨密质，而紧密的骨内膜中常是间充质细胞和非间充质细胞的“混杂体”^[31]；加之，小鼠骨髓间充质的含量仅占0.001%-0.01%^[32]，所以从C57小鼠骨髓中分离间充质干细胞成功率很低^[33]。目前小鼠骨髓间充质细胞的分离主要采用：直接贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法^[34]。虽然后2种方法分离细胞纯度高，但需要骨髓量大、成本高、细胞活性低^[35]；密度梯度离心法对细胞活性影响小，但操作步骤多，细胞流失大，细胞量减少，使获取足够的单个核细胞数量的难度增加。作者这次实验在预实验中利用流式分选CD45阴性细胞进行培养，但是细胞在培养3 d后死亡，无贴壁细胞出现；为了克服方法学缺陷，所以选择了直接贴壁法分离C57小鼠骨髓间充质干细胞，以期借助原有的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子，保持间充质细胞生长的微环境，提高间充质干细胞的产量^[36]，在换液时用缓冲液洗掉非贴壁细胞，最大程度减少非贴壁细胞对小鼠骨髓间充质干细胞的影响，3 d后细胞生长良好，10 d左右可进行传代。研究表明，小鼠骨髓间充质干细胞传代后的潜伏期长于其他动物^[37]，并且小鼠骨髓间充质干细胞对数生长期维持的时间也短(约3 d)，这也加大了小鼠骨髓间充质干细胞的培养难度。实验利用小鼠骨髓间充质干细胞专用培养基和特定的添加物培养小鼠骨髓间充质干细胞，可以有效地克服上述不足，更有利于小鼠骨髓间充质干细胞的培养。

目前国内外多数文献认为小鼠骨髓间充质干细胞CD45表达应该为阴性，但最近贺继刚等^[38]利用C57小鼠心脏干细胞表面分化抗原检测小鼠骨髓间充质干细胞后以CD45，CD31为标准，从第3代小鼠骨髓间充质干细胞中分选出了Sca-1⁺/CD45⁺/CD31⁺等亚型细胞群，并证明了Sca-1⁺/CD45⁺/CD31⁺更能有效地改善心肌的功能，说明在小鼠骨髓间充质干细胞中CD45⁺细胞占有一定的含量，并有助于骨髓间充质干细胞体内修复的功能。实验结果显示C57小鼠间充质干细胞表达CD45(74.6%)，因此表明某些亚群的间充质干细胞可以表达CD45。考虑可能是受到培养的间充质细胞中夹杂较多圆形的黏附在梭形细胞层上可能是造血干/祖细胞的影响^[31]，尽管夹杂的细胞对间充质干细胞有影响，但是实验选择的是传至第3代的间充质干细胞，未见到黏附到间充质表面上的圆形细胞。为了明确分离到的骨髓间充质细胞是否具有间充质干细胞的特征^[39]，实验检测了获取的小鼠骨髓细胞的生长特性，发现其具有黏附在塑料培养器皿的表面；其细胞表面均阳性表达CD105(阳性表达为24.3%)，Scal-1(阳性表达为32.1%)等抗原，CD34(阳性表达为0.8%)C-kit(阳性表达为0.1%)等造血标记为阴性^[40]，该结果与Nadri等^[41]研究结果基本一致。因此实验研究的间充质干细胞高表达CD45很可能是所获得的C57小鼠骨髓间充质干细胞是以Sca-1⁺/CD45⁺/CD31⁺细胞亚群为主的骨髓间充质干细胞。为了明确扩增培养的骨髓间充质细胞处于静止期的比例，检测细胞周期发现G₀/G₁期细胞占细胞总数的64%，约有1/3的细胞进入分裂状态，这表明大部分间充质干细胞为早期细胞，具有高度分化的潜能和典型的干细胞增殖的特点。生长曲线显示细胞生长较慢，细胞倍增时间为(57.11±1.5) h，而细胞群体倍增时间大于24 h为缓慢细胞^[42]，表明小鼠骨髓间充质干细胞为慢增殖细胞，全骨髓培养法培养的间充质干细胞有增殖能力，但细胞的增殖能力较其他细胞较慢^[37]。

由于间充质干细胞目前无特异性的表面标记，对于体外分离培养间充质干细胞的鉴定没有统一的标准，所以最终主要通过其多向分化能力来鉴定小鼠间充质干细胞^[40]。间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化成多种细胞。Giampiero等^[43]研究表明间充质干细胞在体外可以向骨、脂肪和软骨组织分化。实验结果显示小鼠的骨髓间充质干细胞脂肪诱导后第6天油红O染色呈强阳性；成骨诱导第19天茜素红染色呈阳性；成软骨诱导3周甲苯胺蓝染色为阳性。这些表明通过全骨髓法培养的C57小鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，证实了从C57小鼠骨髓中分离出来的细胞为骨髓间充质干细胞符合间充质干细胞国际定义的标准^[44]。

由此来看，全骨髓直接贴壁法培养扩增的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的特征，该类细胞属慢增殖细胞，并且扩增能力较低，这种慢增殖特征的细胞是否用于慢增殖特征的组织(如软骨、关节等)修复更易契合有待于研究。有研究报道人骨髓间充质干细胞接种后有短暂的潜伏期后则进入相对较长的对数增长期^[40]。这就提示当选择间充质细胞作为滋养层刺激造血细胞增殖的研究时可能更能够为人类的临床研究提供有价值的动物实验数据，为临床骨髓间充质干细胞的运用提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

Biological characterization of C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells using a whole bone marrow adherent culture technique

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